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      超聲波破碎儀破碎細胞有哪些常見問題?

      發布時間:2019-05-16 17:42   瀏覽:

      【導讀】超聲波破碎儀是一款可以對物質進行超聲處理多功能、多用途的設備。它廣泛應用于食品、化妝品、環保、醫學、化學、生物制藥等實驗室研究及企業生產。很多朋友說在使用過一些問題,接下來我們就根據大家的疑問來解答,希望您在以后的實驗中可以方便應對這些問題!

      大腸桿菌表達外源蛋白,在超聲破碎的時候,用含有1%triton-X-100的PBS懸浮,然后超聲的效果較好,1%triton-X-100的作用還是較好的,對其他的一些細菌同樣起作用。

      細菌沉淀直接加樣品1buffer,再加5ul的巰基乙醇,混勻,離心,煮沸10min,直接上樣,染色脫色步驟如下:將膠放入適量的染色液微波爐里加熱1min,將染色液換成大量的水在微波爐煮10min就可以。

      在表達重組蛋白后超聲波破碎細胞,采用冰浴,400w,破2s停1s,但是不一會就產生大量泡沫,影響了超聲波細胞破碎儀破碎功率,pbs和tris緩沖液都是這樣,都破碎不完全,而的目的蛋白在這些未破碎的細胞中。

      超聲波破碎儀破碎細胞有哪些常見問題?


      1、會產生氣泡是因為你的探頭位置沒放好。探頭要接近底部,約1cm。功率根據超聲波細胞破碎不同會有所不同,但你可以觀察液面,有波動但不要太劇烈就好。

      2、破3S停10S,破個二三十次看看。

      3、變幅桿位置擺放也要注意,聽聲音如果不對的話就要及時調整。另外可以從菌濃度方面考慮。在破碎時試著加大體積,強度不要超過60%.

      4、嘗試超8s停8s,對有些菌體蛋白來說,你的方法很難散熱,導致蛋白變性產生氣泡,停頓時間稍長一些較好,這種情況多見于包涵體形式的蛋白。

      鏈霉菌超聲破碎的,用的方法條件是什么?

      1、取細菌的24h培養液于5000r/min下離心5min收集菌體

      2、用pH7.5的Na2HPO-NaH2PO緩沖液洗滌3次,再用該緩沖液將菌體配成1:3的菌懸液.置于40mL大塑料試管內

      3、將大塑料試管置于冰浴中,采用超聲波破碎(功率200W,1/2”探頭,破碎30s,間歇30S)

      4、破碎液于12000r/min下高速冷凍離心30min,收集細胞碎片和上清夜.

      超聲破菌流程與上述基本一樣,就是洗滌菌體也可以用預冷的生理鹽水或pH8的Tris-HCl,洗滌一次就可以。另外超聲劑量隨樣品量、菌體改變比較大,超聲波細胞破碎儀的功率可以到400-600w,超5s,停5s,冰浴,要加終濃度1mM的PMSF。為得到適合的超聲強度和次數,需要經常鏡檢觀察菌體是否完全破碎。放線菌屬于原核生物系統進化樹上的摩爾百分含量高的革蘭氏陽性菌分枝類群,它雖然具有原核生物的分子生物學特性,但在其不同類群中,細胞壁的化學組分變化大。

      在做大腸桿菌超聲時,采用的是400W,超5停5的方法,效果不錯,但是用在鏈霉菌上,似乎沒什么效果。會不會就是由于細胞壁組成差異造成的呢,因為大腸桿菌式屬于革蘭氏陰性菌的。

      再有鏡檢是檢驗破碎效果,但是細胞破碎程度和我需要的酶獲得之間有正比關系嗎?破碎時間長也會影響到酶的活性。所以想問問戰友,你提供的功率200W,1/2探頭,破碎30s,間歇30S的條件好像是用于破碎鏈霉菌孢子的,也可以用于發酵離心后的菌泥嗎?如果可以,你破碎的全程時間大概是多少呢?

      如果你需要的是胞內酶,細胞破碎程度和需要的酶獲得之間基本上有正比關系。破碎時間長的確會影響到酶的活性。這就需要在較好的破碎時間和酶活性之間做出判斷,直接的辦法是先繪制相關曲線。

      我的實驗中,破碎的是棒狀桿菌,破碎時間控制在30min左右,酶活較好。

      如果是基質菌絲的話,好可以考慮用溶菌酶處理一下。

      一般來講這幾種方法讀可以的:

      一、液氮研磨

      二、用frenchpress破碎

      三、超聲波破碎

      四、溶菌酶處理預處理

      為什么用塑料大試管,玻璃的不可以嗎?

      答:不可以的。那么先讓我來解釋一下超聲波細胞粉碎儀超聲破碎的原理吧。

      超聲波是物質介質中的一種彈性機械波,它既是一種波動形式,又是一種能量形式。超聲對細胞的作用主要有熱效應,空化效應和機械效應。熱效應是當超聲在介質中傳播時,摩擦力阻礙了由超聲引起的分子震動,使部分能量轉化為局部高熱??栈窃诔曊丈湎?,生物體內形成空泡,隨著空泡震動和其猛烈的聚爆而產生出機械剪切壓力和動蕩。另外,空化泡破裂時產生瞬時高溫高壓,可使水蒸氣熱解離產生.OH自由基和.H原子,由.OH自由基和.H原子引起的氧化還原反應可導致多聚物降解、酶失活、脂質過氧化和細胞殺傷。機械效應是超聲的原發效應,超聲波在傳播過程中介質質點交替地壓縮與伸張構成了壓力變化,引起細胞結構損傷。損傷作用的強弱與超聲的頻率和強度密切相關。所以如果使用玻璃管,可能會碎裂,而通常使用的是塑料試管。

      100g大腸桿菌溶于1L破碎液里,攪拌發現菌液發粘,菌體不能夠好的分散,用超聲波細胞粉碎儀破碎,加壓后,菌液不能進入勻質機,速度很慢,請問是何原因?能有好的辦法解決?

      答:將破碎液的量大,不能較好分散可能是量太大,超聲處理5-10分鐘,菌液粘度可大大降低,也可促進菌體分散。不同型號的超聲波細胞破碎儀功率不一樣,功率的大小決定了使用變幅桿的大小范圍,你使用多大的變幅桿就在設備的上調至該刻度!變幅桿的大小決定了處理量5ml一下選3mm,5~50ml可選6~8mm,50ml以上選10mm的變幅桿,依此類推!

      酵母破碎的問題

      答:一般的PROTOCOL都是用超聲波細胞破碎儀破碎酵母細胞sigmaG-8772酵母破碎效果好的我所做過的方法中還是玻璃珠,效率很高,而且對目的蛋白活性不會有什么影響。一般應該用這個方法?;瘜W裂解的方法,10g酵母加1ml的乙酸乙酯,攪拌至液體狀。此法的裂解效果不錯的加尿素裂解液,在破碎遇到的問題是菌體濃度太低,OD620nm在4-6之間。細胞破碎儀的低破碎體積為4ml左右,這樣我再稀釋一倍,我懷疑破碎完溶出蛋白和酶活測定時會測不準。破碎后,你可將液體放入透析袋中濃縮。

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